In origine la Cattedrale, nonché chiesa parrocchiale di Frascati, era l'antica chiesa di Santa Maria in Vivario. Senonché, col crescere della popolazione, questa chiesa divenne troppo angusta, come riferito dalla relazione del cardinale vescovo Alfonso Gesualdi, risalente al 16 ottobre 1588. Il nuovo cardinale vescovo, Tolomeo Gallo, constatata l'angustia della parrocchiale antica, prese risoluzione di erigerne una nuova. Così sentiti il Governatore della città, il Consiglio della Comunità e papa Clemente VIII, il 24 maggio 1599. I fondi iniziali per la costruzione ammontavano a 1000 scudi versati dal Papa; la fabbrica si approvigionò poi con fondi della Comunità di Frascati, da libere offerte, da prestiti con enti religiosi e privati, e dal 1608 da una tassa imposta sul vino locale venduto. Il progetto fu realizzato dall'architetto Ottaviano Nonni, detto "il Mascherino". Poiché i lavori proseguivano a rilento, per problemi economici, il cardinale vescovo Mariano Pierbenedetti nel 1608 propone alla Comunità di concludere i lavori allo stato in cui sono e di coprire l'edificio per renderlo officiabile. La proposta verrà accettata e la prima messa verrà celebrata nella nuova Cattedrale nel 1610. Fino ad allora erano stati spesi 8000 scudi.
In seguito ad ulteriori lavori, nel 1636 la Cattedrale venne consacrata ufficialmente dal cardinale vescovo Fausto Poli; la consacrazione dell'ultimo altare minore, sito nella cappella di sant'Isidoro, avvenne nel 1680 ad opera del cardinale vescovo Cybo.
Dato che la chiesa era ancora priva di facciata, la Comunità di Frascati con deliberazione del 24 giugno 1696 decise di darsi da fare per la realizzazione della medesima. Venne chiamato l'architetto Girolamo Fontana per tracciare il progetto, che venne messo in opera entro il 1698, per un costo complessivo di 30.000 scudi.
Nel 1703 il cardinale vescovo Lorenzo Corsini curò la risistemazione del presbiterio; nel 1747 vennero disposti gli orologi sui due campanili ai lati della facciata; nel 1788 il cardinale vescovo Enrico Stuart Duca di York donò un nuovo organo alla Cattedrale.
Dato lo stato di decadenza della chiesa, il cardinale vescovo Antonio Maria Cagiano de Azeredo nel 1857 sollecitò pressantemente la Comunità di Frascati ad effettuare lavori, che terminarono in occasione del Sinodo diocesano del 24 maggio 1858. Nel 1908 venne risistemato il pavimento, con particolare cura per le numerose iscrizioni sepolcrali presenti sul piano di calpestio.
L'8 settembre 1943 il bombardamento alleato su Frascati, che colpì duramente l'intera cittadina, rase al suolo l'interno della Cattedrale. Rimasero in piedi la facciata e le mura perimetrali, dalle quali partì la riedificazione dell'edificio, a cura del Genio Civile e del vescovo Biagio Budelacci, completata nel 1949. Il tetto della Cattedrale è stato restaurato nel 1965 e la facciata nel 2002.